如何使用Primer Premier 5軟件設計PCR引物？

攻讀生物相關專業碩士、博士研究生或從事生物相關行業的人員經常會做到PCR實驗，而進行PCR的實驗的首要前提則是需要設計一對好的引物，只有引物設計得恰當、合理，那麼PCR實驗才能進行得順利，並得到自己想要的目的擴增產物。設計PCR引物的網站、軟件有很多種，但最經典的應該算是Primer Premier 5軟件，目前為止，還有不少人用該軟件設計引物，所以這裏就簡要介紹下如何用該軟件進行一般PCR引物的設計。

操作方法

（01）首先下載安裝並激活Primer Premier 5 軟件，打開軟件，點擊左上角，選擇“File”→ “New” →“DNA Sequence”，然後複製參考模板DNA序列，在輸入框內點擊Ctrl+V鍵，將DNA序列粘貼進來:

（02）接着點擊左上角“Primer”按鈕，再點擊“Search” 按鈕：

（03）然後選擇並輸入一些參數，一般最上面點擊“PCR Primer”，下面選擇“Pairs”,然後輸入上游（正義，Sense）鏈引物及下游（反義，Anti-sense）鏈引物的設計位置範圍，這個需要你預先知道你要擴增的片段在哪裏，大概估算一下，比如我想擴增參考模板序列的200-2100中間這1900bp長度的片段，我的上游引物就在1-200之間，下游引物就在1900-最尾部之間；接着再輸入一下PCR產物大小範圍，很簡單，比如我想要200-2100中間的1900bp ,那麼最小的PCR產物大小應該是1900bp,當然，一般軟件設計都會大於這個長度的，所以最大的長度可以不受限，但越長往往越難擴，所以適度就好，這裏我就輸入參考模板的最大長度；然後再選擇一下設計的引物長短區間，一般23±3bp或5bp，引物長度越長，一般退火温度也會越高，搜索模式的話一般是選擇自動“Automatic”：

（04）接着按左下角的“OK”按鈕，再點一次彈出窗口的“OK”：

（05）這時，軟件自動將已經設計好的引物展示在右上角的窗口，默認按引物對的分數從高到低進行排列，選中某一對引物後，左下角會出現該引物對的一些參數，可以讓我們評判好壞，比如髮夾結構、二聚體、有沒有錯配及引物的長度、起始位置、GC含量等，你可以根據自己的要求選擇適合自己的引物，如果是小白的話，建議從分數最高的引物對開始測試PCR擴增效果。

（06）最後，導出我們想到的引物對信息，點擊“File”→ “Print” →“Current Pair”，選擇“Primer Pair”進行打印，一般用虛擬PDF打印機如Adobe、福昕、Doro之類的，確定後選擇保存位置、名字就可以了，後面我們可以打開輸出的PDF軟件瀏覽引物對的信息，並複製這些信息將其送到相應的生物公司進行引物對的合成。