Real-time qPCR入門知識介紹

由於 Real-time qPCR 的眾多優點，現在已經是 現在已經是生命科學領域的一項常規技術。越來越多的研究文章中涉及越來越多的研究文章中涉及 RT-PCR 的實驗，也基本上被 real-time qPC所代替。今天就從 real-time qPCR real-time qPCR 的原理説起，初步認識Real-time qPCR，為菜鳥們引路。

操作方法

（01）實時 PCR 就是在 PCR 擴增過程中 ，通過熒光信號，對 PCR 進程進行實時檢測。一般來講，定量 PCR 儀包括：實時熒光定量 PCR 儀主要由樣品載台 、基因擴增熱循環組件、微量熒光檢測光學系統、微電路控制系統、計算機及應用軟件組成。其中 基因擴增熱循環組件工作原理與傳統基因擴增儀大致相同 ，不同廠家不同型號的產品分別採用空氣加熱、壓縮機制冷、半導體加熱製冷等工作方式。獨特是這個微量熒光檢測系統。有由熒光激發光學部件、微量熒光檢測部件、光路、控制系統組成。常用的熒光激發方式有兩種：滷鎢燈和 LED；熒光檢測元件常用兩種方式：光電倍增管和冷光 CCD 攝像機，光單色元件有濾光片和光柵。在實時 PCR 擴增過程中 ，熒光信號被收集，轉化為成為擴增和熔解曲線。具體數據就是基線，熒光閾值和 Ct 值。

（02）Real-time qPCR 的數學原理：也就是説為什麼 Ct 值跟初始模板的量成正比？首先來看一個 real-time qPCR 中的重要參數（具體的後面會講到 ） Ct 值（ Ct value）， 閾值（ threshold），和基線（ baseline）。 一般來講，第 3-15 個循環的熒光值就是基線，是由於測量的偶然誤差引起的。閾值一般是基線的標準偏差的是 10 倍。在實際操作中也可以手動調節，位於指數期就可以 。 Ct 值就是熒光值達到閾值時候的 PCR循環次數。所以是一個沒有單位的參數。

（03）那麼為什麼説 Ct 值跟初始模板的量程正比呢？？？我們來看 我們來看 PCR 的擴增方程：：

（04）從線性方程上看，斜率（ slope）為 -1/lg(1+E)，所以 E=10^-1/slope-1。如果從標準曲線上得到斜率（ -3.3）， 就可以算出擴增效率（ 0.99）。 一般來講 PCR擴增效率在 90%-110%都是可以用於數據分析的 。效率低於 100%，是由於PCR 反應中存在抑制因素；而高於 100%可能一些污染、非特異性擴增或者是引物二聚體造成。

（05）Real-time qPCR 的種類:一類為探針類 包括TaqMan®探針和 分子信標，利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產物的增加。一類為非探針類，其中包括如 SYBR® Green I 或者特殊設計的引物(如 LUX®Primers) 通過熒光染料來只是產物的增加。

（06）Taqman®探針是最早用於定量的方法。就在 PCR 擴增時加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸：5’端標記一個報告熒光基團 ，3’端標記一個淬滅熒光基團 。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，也就是 FRET 反應 ；PCR 擴增時，Taq 酶的 5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離 ，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條 DNA 鏈，就有一個熒光分子形 成，實現了熒光信號的累積與PCR 產物形成完全同步。而新型 TaqMan-MGB 探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP）， 有望成為基因診斷和個體化用藥分析的首選技術平台 。

（07）分子信標：一種在靶 DNA 不存在時形成莖環結構的雙標記寡核苷酸探針。在此髮夾結構中 ，位於分子一端的熒光基團與分子另一端的淬滅基團緊緊靠近。分子信標的莖環結構中 ，環一般為 15-30 個核苷酸長，並與目標序列互補；莖一般 5-7 個核苷酸長，並相互配對形成莖的結構。熒光基團連接在莖臂的一端，而淬滅劑則連接於另一端。分子信標必須非常仔細的設計，以致於在復性温度下，模板不存在時形成莖環結構，模板存在時則與模板配對。與模板配對後，分子信標的構象改變使得熒光基團與淬滅劑分開。當熒光基團被激發時，它發出自身波長的光子。

（08）SYBR® Green I 是一種結合於小溝中的雙鏈 DNA 結合染料，與雙鏈 DNA 結合後 ，其熒光大大增強 。這一性質使其用於擴增產物的檢測非常理想。SYBR®GreenI 的最大吸收波長約為 497nm ，發射波長最大約為 520nm。在 PCR 反應體系中 ，加入過量 SYBR® Green 熒光染料， SYBR® Green 熒光染料特異性地摻入DNA 雙鏈後，發射熒光信號，而不摻入鏈中的 SYBR® Green 染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與 PCR 產物的增加完全同步。

（09）LUX® (light upon extention) 引物是利用熒光標記的引物實現定量的一項新技術。目標特異的引物對中的一個引物 3’端用熒光報告基團標記。在沒有單鏈模板的情況下，該引物自身配對，形成髮夾結構，使熒光淬滅。在有目標片斷的時候，引物與模板配對，髮夾結構打開，產生特異的熒光信號。